水通道蛋白基因敲除突变体的光合作用

前(几)天收到来自Wiley的关于学生投到The Plant Journal上文章已经上线发表的提醒邮件。意识到该文已入棺,盖馆定论我虽干不了,树碑之事又非我能成。其实,这个碑文早该写了,奈何杂事缠身,几次动手都夭折。今早借着核酸检测的空隙(结果来晚了核酸也最终没做成),先来上几段,或许晚上就写成了。

文章没有什么新的发现,主要描述了三个已经报告与光合相关 OsPIP 基因突变体与野生型材料之间生长及生理功能的差异受植株种植环境及植株所处的生育阶段影响;顺带‘批判了’下那些不考虑环境与生育阶段等因素,就大谈单个基因功能如何强大的工作。很显然,介绍工作本身不是我写博客的目的;事实上,学生在他们自己管理的课题组公众号上有一个关于内容的推文

2017年学院给了我一项‘人才’培育专项。此时,我孤身一人,还躯体在国外,感觉项目的钱也不太用的上。在刚收到经费到账通知后,开始琢磨着干点不那么急的事情,为未来做点铺垫。说来也巧,项目下来没几天,手头的两个关于叶肉导度相关论文审稿意见回来,两个稿子都有审稿者提到实验数据不能解释那部分变化可能是水通道蛋白(AQP)在起作用。做生理生态研究的地球人都知道,这是基本套路,几乎所有做叶肉导度环境响应的都会在讨论中提AQP;而几乎所有做气孔环境响应的都会提脱落酸(ABA)。人少也就轻狂,以至于我内心就觉得AQP和ABA是植物环境响应研究中两块乌黑的‘抹布’:哪里(试验)有污点,哪里就有它们。

当时,叶肉导度相关文献中虽然提AQP的很多,但是真正有证据的极少,两个手肯定有富余(即使到四年后的今天也不多)。既然问题如此重要(这么大一个坑),为何没人做呢?于是乎,联系了一个做水稻遗传转化的公司,利用正火的基因编辑技术(CRISPR-Cas9)把水稻中已经报道的所有质膜镶嵌蛋白(PIP)都给敲了。最初的想法是把TIP和PIP基因家族的21个基因进行多组合敲除的。最终没干成,一方面是钱确实不够,另一方面是人手太缺,毕竟这21个基因一组合会产生数量很可观的株系(当然不排除有不少敲除组合可能直接致死),而我只有彭老师和黄老师资助的两个已有自己课题的学生。

公司的效率相对还是比较高,承诺的材料交付时间是十周左右(实际有将近20周)。因自己在外,遂邀请了懂分子生物学的大学同学王直新参与项目合作,具体负责与公司对接、质量把控、敲除突变纯合单株验证等分子生物学相关的工作;当年从黄老师那‘借来的’学生笑笑负责材料种植和种子繁殖。很遗憾因我的重大疏忽,文章没有挂她为作者!好在,一方面我们这个项目应该还会产生一些文章,有弥补的机会;另一方面,笑笑确实也是相当有担当和大度。这件事情也在提醒着我,回头反思和总结每一个工作从起事到成文发表的必要性。

2017年年底组培的苗子开始陆陆续续进入实验室的生长箱,开始了我们漫长的纯化与扩繁工作。这个工作过程中,还有过不少故事。其中最值得记住的可能是笑笑在收了第一批种子后直接存到-20度冰箱,结果显而易见地都被冻死了。因为这些故事(事故),加之生长箱长起来的苗子很弱,以至于产量奇低(有的单株等上大半年收到十来粒甚至是几粒),整个2018年收到的种子数量极少,基本没可能开展试验。

转眼间时间到了2019年,五月份自己回国了,七月份开始招收的第一批研究生陆续开始来学校。毕竟新生在那个阶段并不知道科研是怎么回事,只是让他们帮帮忙,了解下基本过程,主要是笑笑在管理。直到十月分左右(大概),我才把这个工作全权交给第一个学硕(当年招收的唯一一个)黄显虹来做。最开始我其实都没想让她接,总感觉得她性格有些内向了,要合作的事情可能会困难。有一天,带娃遛盆栽场,偶然发现她其实只是跟我不怎么说话和她的同学们相处的还挺欢快的,我才意识到自己过于武断。

显虹在接手后第一件事情就是与王直新对接完成分子水平的纯种鉴定和纯合体种子繁殖。为了加快繁殖,2019年冬季在海南对挑选出来的纯合材料进行了扩繁。当时刚建立课题组,时刻都想着能尽早出东西,所以几乎所有事情都想着能随时进行正规实验,还刻意第安排了下试验材料在田间的布置。当然,南繁主要是在笑笑和另一位高年级学生婷婷的协助下完成的播种。

2019年下旬到疫情爆发前几天,显虹和笑笑飞赴海南对苗期材料进行了光合和一些农艺性状的测定和调查(所以笑笑挂作者确实是应该的)。后因疫情原因没再去测定和调查其他生育时期了。

疫情,还是在武汉。2020年是我们相当艰苦的一年,学生大半年没有回学校。七月份回学校后才开始准备盆栽,本来计划的是把所有材料都用三种方法测定一次叶肉导度。结果日本晴光周期敏感,显著变短的生育期把学生的节奏给打乱。能感觉到试验中测定的不那么‘友好的’数据让学生万分沮丧;而且因为没有经验,性状测定不全的情况时有发生。年底准备开题时,学生虽然提前很久准备,也很认真,但还是表现的很无助和失望。总觉得自己做的好像啥也不是,找不到故事的组织逻辑和方式。这时候其实我心里没有多少谱,不过我也觉得到了我该出面帮帮她的时候。需要帮她整理下思路,换句话说该准备发发文章了。

一开始,我是不太想碰她实验数据的,因为远没有达到我预期的完成度。所以让显虹从数据库里把当下已发表的文章找出来,写个综述文章。她用了比我预期的更长的时间(其实执行力已经很可以了,只是我性子急且‘选择性’忘了自己当时成长过程中的样子),而且因为没有经验,她并没有把文章找的很全,时常被我发现漏洞;但是这个学生属于那种说啥都能给你笑一笑,让我真是啥脾气没有。现在想想,其实也是我自己成熟的过程,这一过程我时常反思自己,因为她无论如何都算不到差生行列,事情做的不顺利多半与我关系更大。

在准备的过程中我看了一些文献,结合学生收集的数据对这个方向有了比较好的了解。同时也发现,水稻AQP突变体的光合生理过程还真是研究少,一共也就三个基因的突变体材料有相关研究。做相关研究的实验室相当集中,就是来自南京农业大学的两个课题组。某一天,回家路上,我突然意识到或许换个思路能帮她一把。遂让她从已有测定中把别人报道的那三个基因突变的数据单独拎出来,就以此为数据写个文章。

很快,我找她聊了下想法,并让她准备图表。这个过程中我也惊奇发现,她基本把ggplot2作图的基础语法和稍微简单的美化语法解决了。之所以惊奇一方面是没有编程背景的女孩子,在数月时间内能会已经让我惊讶;另一方面我没有刻意教过,虽然我自己和婷婷都有一些现成的代码可以使用。就这么磕磕碰碰地(印象中,因为数据缺失太多,我也发过脾气),我们终于在春节后把文章写出来,这时候离开题已经过去了将近两个月。

写完后没有怎么沉淀。唯一做了的就是把稿子发给组内的所有人和合作者们,希望他们提一些意见。很遗憾,学生们没有人有回应,只有婷婷给我提过一嘴:“感觉文章没啥内容,也就是个Plos One水平吧”。接下来,我又把讨论和前言给圆了圆,让合作者们修订了下拼写和格式等问题。伴随着开学,我自己事情也越来越多,遂在四月上旬把稿件投出去了。当时也没多想,投到Plant Journal纯属意外,就因第一篇AQP突变体光合的文章是发在这个期刊上。

一个月后,一审意见回来。两个审稿人意见都比较正面,编辑的结论是拒稿鼓励重投。把审稿意见认真改了改,两周后投回去。一个月后收到小修后接受的反馈。后面就是接受和校稿等常规工作。

这个文章对于学生显然意味着毕业的准入条件已经达到,可能对于她个人成长也有帮助,属于典型的在自以为的‘破烂’中找到了‘宝贝’。对我自己也是意义非凡的,这是我招收的第一位硕士的文章,是某种形式的处女作。也是我个人通讯或一作在植物生理生态领域还算主流的几本影响因子5分以上期刊发表的第10篇文章(New Phytol两篇、Plant Cell Environ 两篇、J Exp Bot四篇、Plant J 两篇),虽然它确实伴随着极大的偶然性。

全文链接在这:

Xianhong Huang, Zhixin Wang, Jianliang Huang, Shaobing Peng, Dongliang Xiong Mesophyll conductance variability of rice aquaporin knockout lines at different growth stages and growing environments The Plant Journal PDF



成文于华农南苑,带娃间隙